10 نکته کاربردی و مهم در انجام فرایند PAGE یا الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید
الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید (PAGE) یکی از پرکاربردترین روش‌های آزمایشگاهی برای جداسازی ماکرومولکول‌های بیولوژیکی مانند پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک است.
ماکرومولکول‌ها بر اساس تحرک الکتروفورزشان که تابعی از طول، ساختار و بار مولکول است، متمایز می‌شوند. به‌طور کلی، ماکرومولکول‌ها ممکن است در حالت اصلی خود یا به شکل‌های دناتوره‌شده ران شوند.
10 نکته از مهمترین نکات برای انجام فرایند PAGE در زیر خلاصه شده است:
-
تراز کردن درست شیشه‌ها
برای الکتروفورز عمودی، ابتدا دو شیشه (یکی شیشه مربع شکل و دیگری شیشه U شکل) را شست‌و‌شو دهید.
اسپیسرها را پس از چرب کردن مختصر با وازلین، بین دو شیشه قرار دهید و با گیره به هم محکم کنید. جهت اطمینان از نشت ندادن ژل در فضای بین دوشیشه، بعد از سرهم بندی کردن شیشه‌ها، مقداری آب داخل آن بریزید.
-
بافر آماده سازی نمونه حاوی SDS باشد
نمونه مورد بررسی باید با یک دناتوره‌کننده شیمیایی (معمولا SDS) مخلوط شود. SDS یک ماده شوینده آنیونی است که ساختارهای ثانویه و پیوندهای غیر دی سولفید را دناتوره می‌کند و علاوه‌بر این یک بار منفی به هر پروتئین متناسب با جرم آن می‌دهد.
به منظور دناتوره شدن کامل پروتئین‌ها، از حرارت دادن نمونه‌ها تا حداقل 60 درجه سانتیگراد استفاده شود.
علاوه‌بر این از 2ME نیز جهت تخریب پیوندهای دی سولفیدی در ترکیب بافر آماده سازی استفاده می‌شود. یک رنگ ردیاب نیز باید به محلول اضافه شود.
وجود این رنگ به پژوهشگر اجازه می‌دهد لودینگ نمونه را با دقت بالاتری به داخل چاهک‌ها لود نماید. از سوی دیگر حرکت این رنگ در حین الکتروفورز به پژوهشگر ذهنیت نسبتا صحیحی از محل باندهای نمونه ران شده می‌دهد.
فرایند PAGE
-
ولتاژ و شدت جریان مناسب بر اساس ترکیب ژل مورد استفاده انتخاب شود!
اختلاف پتانسیل دو سر ژل (ولتاژ) نیروی محرکه جداسازی نمونه‌های پروتئین در طول فرایند SDS-PAGE است.
شدت جریان و ولتاژ مناسب برای تفکیک صحیح نمونه‌ها، وضوح مناسب باندها، و همینطور جلوگیری از اسمیر شدن و تغییر شکل ژل بسیار مهم است. درصد و ترکیب ژل (قطر منافذ) تعیین‌کننده سرعت ولتاژ و جریان هستند.
اکثر دستورالعمل‌های الکتروفورز عمودی پیشنهاد می‌کنند که ژل‌ها را با ولتاژ ثابت 10-15 V/cm طول ژل برای ژل‌های استاندارد PAGE با ضخامت 1 میلی متر استفاده کنید. این میزان به‌طور کلی برای ژل‌های کوچک حدود 100 ولت و برای ژل‌های بزرگ تا 300 ولت می‌باشد.
-
استفاده از روش فیکساسیون مناسب بر اساس اندازه پروتئین مورد بررسی
دقت داشته باشیدکه پروتئین‌های با وزن مولکولی کمتر از 4 کیلودالتون روی ژل فیکس نمی‌شوند و منجر به ایجاد باند بسیار ضعیف می‌شوند.
برای ران کردن پپتیدهای با این اندازه ژل را با گلوتارآلدهید 5 درصد فیکس کنید و قبل از رنگ آمیزی ژل را به خوبی با آب بشویید.
-
اطمینان از کیفیت و غلظت مناسب ژل جدا کننده (Resolving gel)
بخش جدا کننده ژل SDS-PAGE معمولا غلظت آکریل آمید بیشتر و اندازه منافذ کوچک‌تری دارد که امکان تفکیک پروتئین‌ها را بر اساس وزن ملکولی فراهم می‌کند.
در تهیه این ژل دقت کنید. ابتدا تمامی ترکیبات به‌جز TEMED را با هم ترکیب کنید.
وقتی ژل آماده ریختن شد، TEMED را اضافه کنید. دقت داشته باشید که مقداری از این ژل را داخل فالکون نگه دارید تا براساس آن از بسته شدن ژل ریخته شده داخل شیشه مطمئن شوید. بعد از ریختن ژل داخل محفظه شیشه‌ای، روی آن مقداری ایزوپروپانول بریزید تا حباب‌های احتمالی را از بین ببرد.
-
اطمینان از کیفیت و غلظت مناسب ژل متراکم‌کننده (Stacking gel)
بخش متراکم‌کننده ژل SDS-PAGE معمولا غلظت آکریل آمید کمتر و اندازه منافذ بزرگ‌تری دارد. معمولاً غلظت این ژل 3، 4 و یا 5 ٪ است.
در تهیه این ژل تمام ترکیبات آن به جز TEMED را با هم در یک فالکون مخلوط کنید. وقتی ژل آماده ریختن شد TEMED را اضافه کنید. دقت داشته باشید که مقداری از این ژل را داخل فالکون نگه دارید تا براساس آن از بسته شدن ژل ریخته‌شده داخل شیشه مطمئن شوید.
قبل از ریختن این ژل، ایزوپروپانول روی ژل جدا کننده را با کاغذ صافی بردارید.
-
اطمینان از پلیمریزاسیون صحیح ژل
برای پلیمرایزاسیون صحیح ژل کیفیت کاتالیزور (APS) مورد استفاده و همینطور هم‌دما بودن محلول‌های مورد استفاده با دمای محیط نقش مهمی دارند.
بدین منظور محلول پر سولفات آمونیوم را در هر مرتبه کاری به صورت تازه تهیه کنید.
-
اطمینان از قرار گیری صحیح شانه در ژل
شانه داخل ژل Stacking قرار می‌گیرد. برای قرار دادن شانه، دقت داشته باشید که یکباره شانه را داخل ژل قرار ندهید.
ابتدا یک گوشه شانه را از قسمت U شکل شیشه داخل ژل فرو ببرید و سپس به‌آرامی بقیه شانه را به گونه‌ای که دندانه‌های آن حدود 1.5 سانتی متر از سطح Stacking ژل فاصله داشته باشد؛ در داخل ژل قرار دهید.
پیشنهاد می‌کنیم 12 اشتباه رایج در فرایند الکتروفورز را بخوانید!!
-
حباب گیری
بعد از بسته شدن ژل بالا و خارج کردن شانه از ژل، شیشه‌ها را داخل تانک الکتروفورز عمودی قرار دهید؛ و مخزن تانک و دستگاه را تا ارتفاع مناسب به ترتیب با بافر الکتروفورز پر کنید.
قبل از بارگزاری کردن نمونه‌ها، در قسمت پایین ژل Resolving باید حتما حباب های تشکیل شده را با سرنگ و تزریق بافر از بین ببرید.
-
محاسبه صحیح درصد ژل
درصد ژل تهیه شده باید متناسب با اندازه و وزن مولکولی پروتئین‌های شما باشد. به طور متوسط یک اسیدآمینه دارای وزن مولکولی 110 کیلودالتون است. با توجه به وزن مولکولی پروتئین خود، درصد ژل خود را طبق جدول زیر محاسبه کنید.
| Protein Size | Gel Percentage |
| 10-70 kDa | 12.5% |
| 15-100 kDa | 10% |
| 50-200 kDa | 8% |
| >200 kDa | 4-6% |
سخن آخر در فرایند الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید:
با در نظر گرفتن نکاتی که در سطرهای بالا ذکر شد، فرایند الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید یا PAGE را با درصد خطای کمتر می‌توانید انجام دهید. اگر تجربه‌ای در انجام فرایند الکتروفورز بدون در نظر گرفتن این نکات دارید، در قسمت دیدگاه‌ها برایمان بنویسید.
بسیار عالی و کامل👌👏👏