نکات مهم در فرایند ترانسفورماسیون

ترانسفورماسیون چیست؟

ترانسفورماسیون باکتری به فرایند انتقال DNA خارجی به درون سلول از طریق افزایش نفوذ پذیری غشای سلول گفته می‌شود.

این فرایند یک شکل افقی از انتقال ژن است که برای اولین بار در سال 1928 توسط باکتری شناس بریتانیایی فردریک گریفیت در استرپتوکوک پنومونیه کشف شد.

انتقال ژن با فرایند ترانسفورماسیون

ترانسفورماسیون باکتری به دو روش انجام می‌شود:

 ترانسفورماسیون شیمیایی و الکتروپوریشن سلول‌های مستعد.

بازدهی ترانسفورماسیون به‌عنوان تعداد واحدهای تشکیل‌دهنده کلنی (cfu) تعریف می‌شود که با ترانسفورماسیون 1 میکروگرم پلاسمید به حجم معینی از سلول‌های مستعد شده تولید می‌شود.

این اصطلاح تا حدودی گمراه‌کننده است؛ زیرا در واقعیت 1 میکروگرم پلاسمید به‌ندرت ترانسفورم می‌شود. در عوض، بازدهی به‌طور معمول با ترانسفورم 100pg-1ng از پلاسمید سوپرکویل خالص‌شده در شرایط ایده آل محاسبه می‌شود.

معادله محاسبه بازدهی ترانسفورماسیون (TE) به‌صورت زیر است:

 رقت/ میکروگرم/ تعداد کلونی :TE

 ما نکات توصیه شده خود را برای کمک به دستیابی به حداکثر کارایی ترانسفورماسیون فهرست کرده‌ایم:

پیشنهاد می‌کنیم مطلب 10 نکته مهم در فرایند PAGE یا الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید را مطالعه کنید.

• سلول مستعد شده مورد استفاده

یکی از مهم‌ترین عوامل تأثیرگذار در روند ترانسفورماسیون، استفاده از سلول مستعد شده سویه باکتریایی مناسب با تعداد کپی بالا است که با روش صحیح تهیه و در شرایط  مطلوب ذخیره شده باشند.

سلول مستعد شده‌ای که برای ترانسفورماسیون انتخاب می‌کنید، حتماً در شرایط استاندارد (دمای منفی 70) نگهداری شده باشد.

سلول مستعد شده را بلافاصله بعد از خارج شدن از فریزر 70- حتما داخل ظرف آب یخ (یخ‌های مورداستفاده نه به‌صورت کاملاً پودر شده و نه به‌صورت قطعات بزرگ باشد) قرار دهید تا سلول‌ها به آرامی ذوب شوند.

بعد از حذف کامل کریستال‌های یخ سلول‌های مستعد شده، DNA موردنظر را به میکروتیوب سلول مستعد شده مربوطه بیافزایید و با پیپتاژ به‌خوبی مخلوط کنید.

•  DNA افزوده شده به سلول مستعد شده

حجم DNA که به سلول‌های مستعد شده اضافه می‌شود، بر راندمان ترانسفورماسیون تأثیر می‌گذارد. 1-5 میکرولیتر DNA (پلاسمید یا محصول لیگاسون) برای 50 میکرولیتر از سلول‌های مستعد شده توصیه می شود.

در 50 میکرولیتر از سلول‌های مستعد شده، با افزایش حجم DNA به 10 میکرولیتر (از 2 میکرولیتر) بازده تبدیل به 52 درصد کاهش می‌یابد.

با افزایش حجم DNA به 20 میکرولیتر (از 2 میکرولیتر) بازده تبدیل به 18 درصد کاهش می‌یابد.

با افزایش حجم DNA به 50 میکرولیتر (از 2 میکرولیتر) بازده تبدیل به 5.2% کاهش می‌یابد.

• انکوباسیون دمایی بعد از افزودن DNA به سلول مستعد شده

بعد از افزودن DNA به مدت 20 تا 30 دقیقه انکوباسیون روی آب یخ انجام می‌شود.

این انکوباسیون باعث جذب DNA خارجی توسط گیرنده‌های سطح سلول‌های باکتری مستعد شده می‌شود. برای افزایش راندمان بعد از افزودن DNA چندین مرتبه پیپتاژ انجام دهید.

علاوه براین، در هر 5 دقیقه بهتر است میکروتیوب را خیلی سریع چند مرتبه ضربه بزنین و اسپین کنید و مجدد داخل آب یخ قرار دهید.

• آنتی بیوتیک مورد استفاده

آنتی بیوتیک مورداستفاده درروند ترانسفورماسیون بستگی به ژن مقاومت به آنتی بیوتیک پلاسمید شما دارد.

بنابراین قبل از شروع کار از آنتی بیوتیک انتخابی مناسب با پلاسمید موردنظر خود اطمینان حاصل کنید. از پودر آنتی بیوتیک خود یک استوک کاری با غلظت مشخص تهیه کنید.

بر اساس غلظت نهایی موردنیاز، مقدار موردنیاز از استوک کاری برای افزودن به محیط کشت LB Agar را محاسبه کنید.

به‌عنوان مثال هنگام استفاده از پلاسمیدII  pBlue Script sk باید از آنتی بیوتیک آمپلی سیلین استفاده کنید. این آنتی بیوتیک با غلظت نهایی 100ug/ml باید در محیط کشت افزوده شود.

در صورتی‌که استوک شما با غلظت 100mg/ml تهیه شده است؛ شما باید به ازای هر 1ml محیط کشت، 1 میکرولیتر از آنتی بیوتیک به محیط اضافه کنید.

در جدول زیر تعدادی از آنتی‌بیوتیک‌های رایج به همراه غلظت نهایی آنها آورده شده‌است.

پیشنهاد می‌کنیم مطلب 12 اشتباه رایج در الکتروفورز را مطالعه کنید.

• شوک حرارتی

شوک حرارتی در دمای 42 درجه سانتی‌گراد به مدت 90 ثانیه انجام می‌شود که غشای سلولی را نفوذ پذیر می‌کند و باعث می‌شود DNA وارد سلول شود.

شوک حرارتی زمانی انجام می‌شود که سلول‌ها در فاز لگاریتمی رشد هستند. زمان شوک حرارتی بسیار مهم است. ( کمتر از 90 ثانیه منجر به کاهش میزان ورود و جذب DNA خارجی به داخل سلول باکتری می‌شود و زمان بیشتر از 90 ثانیه منجر به از بین رفتن سلول باکتری می‌شود.)

قبل از شروع پروسه ترانسفورماسیون بن ماری را روی دمای 42 درجه تنظیم کنید.

دقت داشته باشید که بعد از شوک حرارتی، سلول‌ها برای دو دقیقه روی یخ قرار گیرند.

پیشنهاد می‌کنیم: کیت‌های استخراج DNA

• انکوباسیون دمایی در انکوباتور شیکردار

انکوباسیون در انکوباتور شیکردار با دمای 37 درجه و سرعت 250 RPM به مدت 45 دقیقه انجام می‌شود.

در این مرحله بعد از افزودن محیط کشت LB Broth به هر میکروتیوب، درب آن‌ها را پارافیلم بپیچید تا از نشت آن‌ها هنگام تکان خوردن در داخل انکوباتور جلوگیری شود.

میکروتیوب‌های پارافیلم پیچیده را داخل یک ارلن یا بشر قرار دهید و سپس ظرف را داخل انکوباتور فیکس کنید (زمانی که تعداد نمونه‌های شما زیاد است؛ بهتر هست میکروتیوب‌ها را داخل دو ظرف قرار دهید تا امکان shaking مناسب فراهم شود.)

قبل از شروع پروسه ترانسفورماسیون دمای انکوباتور را روی 37 درجه تنظیم کنید.

پیشنهاد می‌کنیم: نکات مهم در فرایند PCR را مطالعه کنید.

• کشت صورت گرفته روی پلیت

کشت روی پلیت در سطح LB Agar حاوی آنتی بیوتیک انجام می‌شود. پلیت‌های باکتریایی اندازه‌های متفاوتی دارند. پیشنهاد می‌شود از پلیت استاندارد با اندازه 8 سانتی‌متر استفاده کنید.

بعد از ذوب کردن محیط LB Agar در داخل مایکروویو، ظرف را به مدت 5 تا 10 دقیقه در دمای اتاق قرار دهید تا از حرارت آن کاسته شود. متناسب با تعداد پلیت‌ها و اندازه آن‌ها، در داخل یک فالکون 50 میلی لیتری در مجاورت شعله محیط ذوب شده LB Agar را بریزید.

نکته: آنتی بیوتیک را زمانی به محیط اضافه کنید که دمای محیط داخل فالکون پشت دست را نسوزاند.

نکته: افزودن انتی بیوتیک به محیط داغ منجر به غیر فعال شدن آن می‌شود.

بعد از افزودن آنتی بیوتیک فالکون را چندین مرتبه سر و ته کنید تا محیط یکنواخت شود.

سپس در مجاورت شعله به مقدار مشخص داخل هر پلیت محیط را اضافه کنید. پلیت‌های حاوی محیط را تا زمان جامد شدن محیط کنار شعله قرار دهید.

برای بهینه کردن زمان پیشنهاد می‌شود در بازه زمانی که انکوباسیون نمونه‌ها در انکوباتور شیکردار انجام می‌شود؛ آماده سازی پلیت‌ها صورت گیرد.

• پیپت مورد استفاده برای کشت

کشت روی سطح جامد LB Agar توسط پیپت پاستور شیشه‌ای خم شده توسط شعله (طبق تصویر شماره یک) یا سواپ انجام می‌شود. (پیپت شیشه‌ای برای کشت چمنی و سواپ برای کشت ناپیوسته)

قبل  از کشت، حتما پیپت پاستور خم شده را برای 5 تا 10 ثانیه روی شعله بچرخانید تا کاملاً استریل شود. هنگام قرار دادن پیپت استریل شده روی سطح جامد آگار از سرد شدن آن اطمینان حاصل کنید. به گونه ای که ابتدا پیپت را یه یک گوشه از پلیت قرار دهید؛ سپس کشت را انجام دهید.

توجه: اگر نمونه‌های متفاوت را با یک پیپت کشت می‌دهید؛ بعد از کشت اول و بستن درب پلیت، پیپت استفاده شده را با الکل 70 درصد اسپری کنید و بعد روی شعله بگیرید. این کار را بهتر است دو تا سه مرتبه انجام دهید تا کاملا استریل شود. بدین صورت این پیپت برای کشت دوم قابل استفاده است.

 10 نکته کلیدی در طراحی پرایمر را بخوانید!

• کنترل‌های پروسه ترانسفورماسیون

در هر مرتبه کاری، باید حتماً یک کنترل مثبت و کنترل منفی در نظر بگیرید تا صحت و دقت انجام کار قابل ارزیابی باشد.

برای کنترل مثبت پلاسمید (بدون DNA خارجی) حلقوی ( که فرم خطی شده آن را برای مرحله لیگاسون استفاده کرده‌اید)  را به سلول مستعد شده اضافه کنید. برای کنترل منفی هیچ نمونه‌ای به سلول مستعد شده افزوده نمی‌شود.

• زمان انکوباسیون پلیت‌های کشت شده

بعد از اتمام کشت، پلیت‌ها را به مدت 30 دقیقه در کنار شعله قرار دهید تا جذب محلول کشت شده روی آگار به‌طور کامل انجام شود.

سپس پلیت‌ها را به‌صورت برعکس داخل انکوباتور با دمای 37 درجه قرار دهید.

بهترین زمان انکوباسیون 16 ساعت می‌باشد. انکوبه شدن بیشتر از زمان ذکر شده باعث ایجاد کلونی‌های اقماری در مجاورت کلونی‌های اصلی می‌شود. انکوبه شدن کمتر از زمان پیشنهادی باعث شکل گیری تعداد کلونی‌های کمتر و سوزنی شکل می‌شود.

مشاهده پلیت کنترل مثبت با کلونی‌های بسیار متراکم و گسترده و پلیت کنترل منفی بدون هیچ گونه کلونی رشد یافته نشاندهنده فرآیند ترانسفورماسیون خوب و صحیح می‌باشد. 

سخن آخر در فرایند ترانسفورماسیون:

با توجه به نکاتی که در سطرهای بالا ذکر شد، می‌توانید ترانفورماسیون را به بهترین نحو ممکن انجام دهید. قطعاً همه این نکات حائز اهمیت بوده و لازم‌الاجرا می‌باشند.

به نظر شما کدام نکته از سایر نکات اهمیت بیشتری داشته و در صورت رعایت نکردن آن، نتیجه‌ای حاصل نمی‌شود؟