12 اشتباه رایج در فرایند الکتروفورز

در این مقاله با تعریف الکتروفورز و کاربرد آن و سپس با اشتباهات رایج در حین فرایند الکتروفورز آشنا خواهید شد.

الکتروفورز چیست؟

الکتروفورز تکنیکی است که از جریان الکتریکی برای جداسازی DNA، RNA یا پروتئین­‌ها بر اساس ویژگی‌­های فیزیکی مانند اندازه و بار استفاده می­‌کند. DNA و RNA به دلیل داشتن بار منفی پس از برقراری جریان الکتریکی از طریق منافذ ژل آگارز به سمت انتهای مثبت ژل مهاجرت می‌کنند.

باندهای حاصل را می­‌توان با استفاده از نور فرابنفش (UV) یا نور LED آبی مشاهده کرد. الکتروفورز، کارآمدترین روش برای جداسازی قطعات DNA در اندازه­‌های 100 جفت باز تا 25 کیلوباز است.

برای جداسازی پروتئین­‌ها (برخلاف DNA و RNA، پروتئین‌­ها با توجه به تنوع آمینواسیدهای تشکیل­‌دهنده از نظر بار متفاوت هستند) اغلب از ژل‌های پلی آکریل آمید که منافذ کوچک‌تری دارند، استفاده می­‌شود.

استخراج RNA اولین و مهمترین مرحله شروع یک واکنش است. در این مطلب به 10 اشتباه رایج که می‌توانند به طور کلی سرنوشت تخلیص و استخراج را تغییر دهند، پرداختیم. پیشنهاد می‌کنیم حتماً آن را مطالعه کرده و از بروز اشتباه جلوگیری کنید.

10 اشتباه مهلک هنگام تخلیص RNA

 

الکتروفورز چیست؟

 اشتباهاتی که در حین فرایند الکتروفورز رخ می­‌دهند:

اشتباهات رایجی که در هنگام فرایند الکتروفورز رخ می‌­دهند، عبارت است از:

1. استفاده از درصد ژل نامناسب

درصد آگارز موجود در یک ژل بر اندازه منافذ و سرعت عبور ذرات تأثیر می‌گذارد؛ در نتیجه بر کیفیت جداسازی نمونه یا لدر روی ژل اثرگذار است.

اطمینان حاصل کنید که درصد ژل برای تفکیک اندازه قطعات موردنظر در نمونه مناسب است؛ در غیر این صورت تصویر واضحی از باندها نخواهید داشت.

قطعات مولکولی کوچک­تر به درصد ژل بیشتری نیاز دارند. هرچه درصد آگارز بیشتر باشد، اندازه منافذ کوچک‌تر است، بنابراین مولکول‌ها کوچک‌تر با سرعت کمتر عبور می‌­کنند. غلظت پایین ژل آگارز برای آنالیز قطعات DNA طولانی‌­تر مناسب است و بالعکس.

2. استفاده از لدر نامناسب

مهم‌­ترین عامل در انتخاب یک Ladder DNA، اندازه مورد انتظار باندهای DNA در آزمایش شما است. باید مطمئن شوید که تعداد و اندازه باندهای لدر، از کوچک‌ترین تا بزرگ‌ترین قطعه آن، محصول PCR شما را پوشش می‌­دهد.

بیان ژن چیست و چگونه ژن‌‌ها بیان می‌شوند؟

 

3. استفاده از شانه غیر تنظیم

از تراز بودن شانه بر روی tray اطمینان حاصل کنید. برای جلوگیری از نشت نمونه از پایین ژل، شانه را تا انتهای ژل فشار ندهید.

از پر کردن بیش از حد tray ژل خودداری کنید؛ زیرا ممکن است منجر به اتصال چاهک‌­ها شود. پس از بستن ژل، شانه را با دقت و به‌­طور پیوسته بردارید تا از آسیب به چاهک‌­ها جلوگیری شود.

4. ضخامت ژل نامناسب

ضخامت ژل افقی آگارز را در حدود 3-4 میلی متر نگه دارید. ژل­‌های ضخیم‌­تر از 5 میلی متر، منجر به پخش شدن باند در طول الکتروفورز می­‌شوند.

5. استفاده از بافر با غلظت نامناسب

بافرها PH نسبتاً ثابتی دارند و به دلیل غلظت یون هیدروژن، قادر به هدایت جریان الکتریسیته هستند.

اطمینان حاصل کنید که بافرهای آماده سازی ژل و بافر مورد استفاده برای ران کردن ژل یکسان بوده و با غلظت مناسب آماده شده‌اند. برای الکتروفورز بیش از دو ساعت از بافر با ظرفیت بافری بالا استفاده کنید.

6. استفاده از بافر نامناسب

دو بافر رایج مورد استفاده در الکتروفورز DNA محلول‌­های TAE و TBE هستند. قطعات DNA دو رشته‌­ای خطی در بافر TBE در مقایسه با بافرهای TAE تقریباً 10٪ کندتر مهاجرت می‌­کنند.

بنابراین TAE برای تمایز قطعات DNA کوچک­‌تر بهتر است؛ در حالی که TBE برای افتراق قطعات DNA بلندتر مناسب است.

7. استفاده از loading dye نامناسب

Loading dye حاوی رنگ‌­هایی است که در طول­‌های مختلف DNA بر روی ژل مهاجرت می­‌کنند.

برای مثال زایلن سیانول مانند یک قطعه DNA کوتاه و Orange G شبیه به یک قطعه DNA سنگین در طول ژل حرکت می­‌کند. اگر رنگ مورد استفاده دارای اندازه مولکولی مشابه با اسید نوکلئیک باشند، باندهای مورد بررسی ما را می‌پوشانند.

پس اندازه مهاجرت ظاهری Loading dye مورد استفاده در الکتروفورز را بررسی کنید.

8. لود میزان نامناسب از نمونه

اگر میزان DNA لود شده بیش از حد باشد، بر مهاجرت نمونه در طول ژل تأثیر می­‌گذارد. در نتیجه کندتر حرکت می‌­کند و بنابراین اندازه قطعه بزرگ‌­تر از آنچه هست به نظر می‌­رسد.

در مقابل تشخیص DNA خیلی کم بر روی ژل سخت است و باندهای کوچک­‌تر کم رنگ به نظر می‌­رسند.

9. مقادیر ناکافی بافر تانک

یک ژل باید به‌­طور کامل در بافر تانک غوطه‌­ور شود؛ به­‌طوری که 3 تا 5 میلی متر از سطح ژل را بپوشاند.

مقادیر ناکافی از بافر تانک می‌­تواند باعث وضوح ضعیف باندها، انحراف باندها و حتی ذوب شدن ژل شود. از طرفی، مقادیر بیش از حد از بافر تانک نیز می‌­تواند تحرک DNA را کاهش دهد و باعث انحراف باندها شود.

10. استفاده از ولتاژ نامناسب

ولتاژ را متناسب با محدوده اندازه قطعات اسید نوکلئیک و غلظت بافر تانک اعمال کنید. ولتاژ بسیار کم یا زیاد می­‌تواند وضوح کمتری در جداسازی اسیدهای نوکلئیک ایجاد کند.

11. عدم توجه نسبت ولتاژ به شدت جریان

استفاده از بافر قدیمی یا بافری که بارها استفاده شده است، موجب برهم خوردن نسبت ولتاژ به شدت جریان می­‌شود که بر کیفیت باندها اثرگذار است.

12. اتصال نادرست قطب های مثبت و منفی پاور ساپلای

یکی از ناامیدکننده‌­ترین (و در عین حال ساده‌ترین) اشتباهات اتصال نادرست قطب­‌های مثبت و منفی منبع تغذیه است.

در نتیجه ژل به سمت عقب حرکت می‌­کند. از آنجایی که چاهک‌­ها بسیار نزدیک به انتهای ژل هستند؛ اگر بلافاصله متوجه خطا نشوید، به احتمال زیاد تمام نمونه‌­های خود را از دست خواهید داد.

سخن آخر:

انجام هر یک از کارهای اشتباهی که در سطرهای بالا به آن اشاره شد؛ ممکن است کل فرایند الکتروفورز را دچار اختلال کرده و باعث از دست دادن نمونه­‌ها شود.

پس سعی کنید در حین انجام الکتروفورز حواس خود را جمع کرده و به این ترتیب از بروز این اشتباهات خودداری کنید. اگر تجربه انجام این اشتباهات را حین انجام الکتروفورز داشتید، در قسمت نظرات برایمان بنویسید.