10 نکته کلیدی در طراحی پرایمر

طراحی پرایمر مهم‌ترین بخش از فرایند راه اندازی  یک تست RT-PCR کمی برای تجزیه و تحلیل بیان ژن است.

اگر پرایمرهای مورد استفاده برای qPCR توانایی کمی برای اتصال به توالی هدف داشته باشند و یا به بیش از یک توالی متصل شوند؛ می‌توانند به‌طور قابل توجهی بر کیفیت و قابلیت اطمینان نتایج شما تأثیر بگذارند.

10 اشتباه مهلک در تخلیص و استخراج RNA  

 

برای اجتناب از این مشکلات باید نکات متعددی را در فرایند طراحی پرایمر مناسب برای دستیابی به یک واکنش با کیفیت در نظر گرفت:

•  طول محصول PCR یا امپلیکون:

یکی از پارامترهای مؤثر برای تکثیر کارآمد با روش RT-PCR، اندازه امپلیکون است.بدین جهت پرایمرها را طوری طراحی کنید که آمپلیکون بین 75 تا 200 جفت باز باشد.

محصولات PCR کوتاه معمولاً با راندمان بالاتری نسبت به محصولات طولانی‌تر تکثیر می‌شوند؛ اما محصول PCR باید حداقل 75 جفت باز باشد تا به راحتی آن را از پرایمر-دایمرهایی که به‌طور بالقوه تشکیل می‌شوند، تشخیص داد.

12 اشتباه رایج در فرایند الکتروفورز

 

• دمای ذوب:

دمای ذوب (Tm) پرایمر در هر دو آزمایش PCR و qPCR نقش مهمی ایفا می‌کند.

این دمایی است که در آن DNA دوبلکس، که معمولاً به‌عنوان DNA دو رشته‌ای شناخته می‌شود، به دو DNA تک رشته‌ای تقسیم می‌شود.

علاوه‌بر این، Tm دمای اتصال پرایمر به توالی هدف (Ta) را نیز تعیین می‌کند، جایی که اتصال پرایمر در بالاترین میزان کارایی و اختصاصیت رخ می‌دهد. Ta بر مقدار نهایی محصول PCR و qPCR تأثیر می‌گذارد.

به‌عنوان یک قاعده کلی، دمای ذوب ایده آل برای پرایمر 60 درجه سانتی گراد است (با حداکثر اختلاف 3 درجه سانتی گراد در دمای ذوب دو پرایمر فوروارد و ریورس).

البته در صورتیکه توالی ژن هدف شما امکان طراحی چنین پرایمری را ندهد، دمای ذوبی در رنج 55-65 درجه سانتیگراد قابل قبول است (توجه داشته باشید که فاصله دمایی دو پرایمر فوروارد و ریورس نباید از 3 درجه تجاوز کند).

برای تعیین این دماها می‌توانید از Calculator Tm استفاده کنید.

• هدف گیری پرایمر به ناحیه اتصال دو اگزون:

برای جلوگیری از تکثیر DNA ژنومی، حداقل یکی از پرایمرها روی محل اتصال دو اگزون قرار گیرد.

برای این منظور پرایمر را طوری طراحی کنید که بخشی از پرایمر به انتهای ‘3 اگزون بالادست و بخش دیگر به انتهای ‘5 اگزون پایین دست هیبرید شود.

توجه داشته باشید طول ناحیه متصل شونده به انتهای ‘5 اگزون پایین دست از 10 نوکلئوتید بیشتر و از 5 نوکلئوتید کمتر نباشد. ضمناً توجه کنید که توالی متصل شونده به اگزون پایین دست با ناحیه ‘5 ابتدایی اینترون بین این دو اگزون مشابهتی نداشته باشد.

برای تأیید این موضوع می‌توانید پرایمر طراحی شده را در مقابل توالی ژنومی ارگانیسم مورد بررسی تان بلاست کنید و یا با استفاده از نرم افزار پرایمر بلاست توانایی تولید محصول PCR توسط پرایمرهای طراحی شده را (در مقابل توالی ژنومی) ارزیابی کنید.

نکات کلیدی در طراحی پرایمر

• محتوای GC:

سعی کنید محتوای GC پرایمرها بین 40 تا 60٪ باشد و انتهای 3´ این پرایمر به G یا C ختم شود تا قدرت اتصال را افزایش دهید.

این نوکلئوتیدها به‌عنوان گیره GC شناخته می‌شود. بازهای G و C پیوند هیدروژنی قوی‌تری دارند و به پایداری پرایمر کمک می‌کنند. توجه داشته باشید که باز‌های G یا C بیش از حد تکرار شونده نداشته باشید، زیرا این امر می‌تواند باعث تشکیل پرایمر-دایمر شود.

بیان ژن چیست و چگونه ژن‌ها بیان می‌شوند؟ 

 

• ساختارهای ثانویه:

تشکیل ساختارهای ثانویه بر توانایی اتصال پرایمر به توالی هدف و در نتیجه تکثیر واکنش تأثیر منفی می‌گذارند؛ و دسترسی پرایمرها به واکنش را تا حد زیادی کاهش می‌دهند. این ساختارها شامل سه نوع مختلف هستند:

1. ساختار سنجاق سر: در اثر فعل و انفعالات درون مولکولی در پرایمر ایجاد می‌شود و باید از آن اجتناب کرد.
2. Self-Dimer: یک پرایمر خود دایمر از برهمکنش‌های بین مولکولی بین دو قسمت یک پرایمر تشکیل می‌شود، جایی که پرایمر با خودش همولوگ است.
3. Cross Dimer: دایمرهای متقاطع پرایمر از برهمکنش بین مولکولی بین پرایمرهای رشته سنس و آنتی‌سنس در نواحی همولوگ تشکیل می‌شوند.

• تکرارها:

تکرار یک دی نوکلئوتید است که چندین بار متوالی رخ می‌دهد و باید از آن اجتناب شود؛ زیرا ممکن است misprime شوند. به‌عنوان مثال: ATATATAT. حداکثر تعداد تکرارهای دی نوکلئوتید قابل قبول در پرایمر 4 دی نوکلئوتید است.

• Runs:

به‌طور کلی باید از پرایمرهای دارای ران طولانی از یک تک نوکلئوتید اجتناب شود. برای مثال، AGCGGGGGATGGGG دارای ران‌های باز ‘G’ با تکرار 5 و 4 است.

حداکثر تعداد ران‌های پذیرفته شده 4 جفت باز است. البته بازهم توصیه می‌شود در صورت امکان از وجود این ران‌ها اجتناب کرد.

• اجتناب از ساختار ثانویه الگو:

مشابه ساختارهای ثانویه پرایمر، ساختارهای ثانویه توالی الگو می‌تواند در حین یا بعد از مرحله دناتوراسیون تشکیل شود؛ زیرا ssDNA عموماً ناپایدار است و می‌تواند خود به خود به ساختارهای ثانویه تبدیل شود.

اگر یک ساختار ثانویه الگو تشکیل شود که حتی در دمای بالاتر از دمای اتصال پرایمرها پایدار باشد؛ پرایمرها قادر به اتصال به توالی هدف نیستند و تکثیر PCR به‌طور قابل توجهی تحت تأثیر قرار می‌گیرد.

بنابراین در نظر گرفتن ساختار ثانویه الگو به ویژه در طراحی پرایمر qPCR مهم است.

• طول پرایمر:

پرایمرهای qPCR مانند پرایمرهای PCR باید با طول 18 تا 24 نوکلئوتید برای تکثیر ایده‌آل طراحی شوند.

پرایمرهای طویل سرعت هیبریداسیون کندتر و شانس کمتری برای اتصال به توالی هدف مورد نظر دارند.

هیبریداسیون آهسته‌تر باعث ایجاد اختصاصیت ناکافی و اتصال ناکافی به توالی هدف می‌شود؛ در حالی که سرعت هیبریداسیون سریع‌تر منجر به حداکثر اتصال به توالی هدف می‌شود. خطر هیبریداسیون کندتر زمانی افزایش می‌یابد که پرایمر بیشتر از 30 جفت باز باشد.

10 نکته ضروری در واکنش PCR

اگرچه پرایمرهای طویل دارای سطح اختصاصیت بالاتری نسبت به پرایمرهای کوتاه هستند؛ اما در مرحله اتصال به توالی هدف کارایی کمتری دارند و بازده آمپلیکون کمتری تولید می‌کنند.

از طرفی افزایش تعداد چرخه‌های واکنش منجر به تولید محصولات غیر اختصاصی و از بین رفتن اجزای لازم برای سنتز DNA و نهایتا کاهش کارآمدی واکنش می‌شود.

با این حال، پرایمرهای کوتاه، به‌طور مؤثرتری به توالی هدف خود متصل می‌شوند و در مقایسه با پرایمرهای طولانی، به چرخه‌های PCR کمتری برای تولید آمپلیکون نیاز دارند.

• ابزارهای طراحی پرایمر:

از آنجایی که پرایمرها، متغیر کلیدی در کیفیت واکنش‌های PCR و qPCR هستند و نتیجه تکثیر را تعیین می‌کنند، انتخاب یک پرایمر و ابزار طراحی قابل اعتماد و دقیق بسیار مهم است.

PrimerQuest IDT یکی از بهترین ابزارهای موجود است. استفاده از آن آسان و دارای چندین مزیت از جمله قابلیت تغییر پارامترها است.

Primer3 ،MRPrimerW ،BatchPrimer3 ،Primique ،QuantPrime ،Primer-BLAST و Oli2go از دیگر ابزارهای مفید و قابل اعتماد طراحی پرایمر برای qPCR هستند.

سخن آخر: 

با رعایت کردن این نکات می‌توانید در طراحی پرایمر و بیان ژن موفق عمل کرده و از تکرار مجدد جلوگیری نمایید. اگر ابزارهای مفید دیگری در طراحی پرایمر می‌شناسید، در قسمت دیدگاه‌ها برای ما بنویسید.