10 نکته ضروری در واکنش PCR
PCR (واکنش زنجیرهای پلیمراز) چیست؟
واکنش زنجیرهای پلیمراز یا PCR یکی از شناخته‌شده‌ترین تکنیک‌ها در زیست‌شناسی مولکولی است و به‌عنوان یک ابزار رایج در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی و بالینی در تعیین توالی ژنوم، شناسایی عوامل پاتوژن و عفونت‌ها، پزشکی قانونی و تحقیقات بیولوژیکی مورد استفاده قرار می‌گیرد.
PCR یک فرآیند بیوشیمیایی است که قادر به تکثیر یک مولکول DNA به‌صورت تصاعدی و تولید میلیون‌ها نسخه از DNA هدف در مدت زمان کوتاهی است. PCR را می‌توان با استفاده از DNA استخراج شده از انواع بافت‌ها و ارگانیسم‌ها، از جمله خون محیطی، پوست، مو، بزاق و میکروب‌ها انجام داد.
از آنجایی‌که قبل از انجام واکنش PCR ،DNA باید استخراج شود؛ پس فرایند استخراج امر بسیار مهم و کلیدی است.
کیت‌های استخراجی با حساسیت و دقت بالا استخراج ماده ژنتیکی را انجام می‌دهند.
با توجه به حساسیت روش PCR، تنها مقادیر کمی از DNA برای تولید نسخه‌های کافی به‌منظور تجزیه و تحلیل با استفاده از روش‌های آزمایشگاهی مرسوم مورد نیاز است. در هر آزمایش PCR به DNA الگو، پرایمرها، نوکلئوتیدها و DNA پلیمراز نیاز است.
نکات ضروری در واکنش PCR
-
تهیه میکس واکنش
در ابتدای انجام واکنش متناسب با تعداد نمونه مورد بررسی، میزان مورد نیاز از هر ماده را محاسبه نمایید.
تمام مواد را در قالب یک مسترمیکس آماده تهیه نموده و سپس درون میکروتیوب‌های مربوطه الیکوت نمایید. تهیه این میکس موجب کاهش مراحل سمپلیینگ می‌شود. به این ترتیب خطر بروز خطای کاربری کمتر شده و احتمال بروز آلودگی نیز کاهش می‌یابد.
12 نکته مهم در فرایند الکتروفورز را بخوانید.
-
لحاظ کردن 10 درصد خطای سمپلینگ
در حین آماده سازی میکس حتماً 10 درصد خطا سمپلینگ را در نظر بگیرید.
به‌عنوان مثال اگر تعداد نمونه‌های شما 10 می‌باشد؛ با در نظر گرفتن خطا سمپلینگ، میکس خود را برای 11 نمونه تهیه کنید.
-
استفاده از سمپلر مناسب
با توجه به حساسیت روش PCR و از طرفی اهمیت غلظت نهایی مواد به کار برده شده در واکنش، از کالیبر بودن سمپلرها اطمینان حاصل نمایید.
برای جلوگیری از انتقال آلودگی، سمپلرهای PCR از سمپلرهایی که برای افزودن DNA و یا در مراحل استخراج استفاده می‌شود، متمایز باشند.
مواد مصرفی در آزمایشگاه را از اینجا می‌توانید تهیه کنید.
-
استفاده از میکروتیوب مناسب
از کیفیت میکروتیوب‌های مصرفی مطمئن شوید.
درب برخی میکروتیوب‌ها به خوبی محکم نمی‌شود و همین امر موجب تبخیر مواد مصرفی حین انجام واکنش و به هم خوردن غلظت مواد مورد نیاز می‌شود.
-
بهینه سازی غلظت پرایمرهای PCR
توالی پرایمر و غلظت پرایمر مناسب برای حداکثر اختصاصیت و کارایی در PCR ضروری است.
استفاده از غلظت بیش از حد پرایمرها می‌تواند شانس اتصال غیر اختصاصی پرایمرها به مکان‌های نامطلوب روی الگو یا به یکدیگر را افزایش دهد.
از طرف دیگر اگر غلظت پرایمر کم باشد، می‌تواند منجر به عدم تکثیر یا تکثیر کم هدف موردنظر شود. برای بهینه سازی غلظت پرایمر می‌توانید از گردیانت غلظتی استفاده کنید.
-
تناسب زمان های واکنش pcr با طول محصول PCR
همه‌ی زمان‌ها در مراحل مختلف واکنش باید متناسب با طول DNA الگو باشد.
- اگر زمان extension خیلی کوتاه باشد، زمان کافی برای همانندسازی کامل الگو وجود نخواهد داشت. اگر طولانی باشد؛ می‌تواند باعث تکثیر نواحی غیر اختصاصی شود. (به ازای هر یک کیلو جفت باز توالی هدف، یک دقیقه برای زمان تکثیر در نظر بگیرید).
- اگر زمان annealing خیلی کوتاه باشد، پرایمرها زمان کافی برای اتصال به الگو را ندارند.
- اگر زمان denaturation بیش از حد طولانی باشد، DNA ممکن است تخریب شود. اگر خیلی کوتاه باشد، DNA به طور کامل دناتوره نمی‌شود و راندمان تکثیر پایین خواهد بود.
-
کمیت و کیفیت نمونه‌های DNA
واکنش PCR می‌تواند تحت تأثیر کیفیت و کمیت الگوی DNA شما قرار گیرد.
یک الگوی “تمیز” اختصاصیت واکنش و بازده محصول را افزایش می‌دهد.
مراقب باشید که در طی استخراج توالی الگو از آلودگی جلوگیری کنید. آلودگی پروتئین یا شیمیایی می‌تواند منجر به پس زمینه غیر اختصاصی شود یا واکنش PCR شما را کاملاً از بین ببرد. بررسی کنید که جذب DNA شما دارای نسبت 1.8 ≥ 260/280 باشد.
برای کاهش شانس اتصال غیر اختصاصی در طی واکنش، تا حد امکان از مقدار الگوی DNA کم استفاده کنید.
توصیه می‌کنیم هنگام تکثیر DNA پلاسمید از 1 نانوگرم و هنگام تکثیر DNA ژنومی از 100 نانوگرم استفاده کنید.
همچنین بخوانید: 10 اشتباه مهلک هنگام تخلیص و استخراج RNA
-
افزایش حساسیت واکنش
با استفاده از آنزیم‌های hot start می‌توان حساسیت واکنش را بالا برد.
برخی از آنزیم‌های پلیمراز هنگامی که در دمای اتاق یا 4 درجه سانتی‌گراد قرار می‌گیرند، فعالیت کمی از خود نشان می‌دهند.
پس از مخلوط کردن اجزای مختلف واکنش، پرایمرها ممکن است به‌طور غیر اختصاصی به توالی الگو اتصال یابند که منجر به تولید یک سری محصولات غیر اختصاصی می‌شود.
برای جلوگیری از ایجاد این محصولات غیر اختصاصی، می‌توان از پلیمرازهای hot start استفاده کرد.
یک راه دیگر برای افزایش حساسیت واکنش استفاده از آنزیم‌های پلیمراز با fidelity بالا می‌باشد. علاوه‌بر این با افزودن MgCl2 به‌عنوان کوفاکتور آنزیم پلیمراز می‌توان حساسیت واکنش را بالا برد.
-
آلودگی زدایی فضای کار
یکی از مهم‌ترین عوامل تاثیرگذار بر نتایج یک واکنش، تهیه میکس واکنش و الیکوت سازی آن در work station تمیز می‌باشد.
بدین منظور قبل از شروع واکنش تمامی مواد مصرفی از جمله میکروتیوب‌ها، نوک سمپلر و سمپلرها را داخل work station قرار داده و به مدت 20 دقیقه چراغ uv را روشن کنید.
در نظر داشته باشید که جهت جلوگیری از آلودگی، work station و فضای افزودن DNA کاملاً جداگانه از فضای تهیه میکس و الیکوت سازی باشد.
در پایان کار، نوک سمپلرهای استفاده شده را از زیر work station خارج کنید و مجدد به مدت 10 دقیقه چراغ UV آن را روشن کنید.
-
تکثیر محصولات PCR غنی از GC
یک الگوی غنی از GC به یک توالی DNA اشاره دارد که در آن 60٪ (یا بیشتر) از بازهای موجود G (گوانین) یا C (سیتوزین) هستند.
تکثیر محصولات PCR غنی از GC از طریق PCR دشوار و چالش‌برانگیز است.
این ممکن است به دلیل مشکل در دناتوره شدن DNA یا امکان تشکیل ساختارهای ثانویه مانند سنجاق سر و دمای ذوب بالا باشد.
برای افزایش راندمان تکثیر این توالی‌ها بهتر است با استفاده از گرادیان دمایی، دمای annealing بهینه را پیدا کنید.
علاوه‌بر این با افزودن مولکول‌های آلی همچون فرمامید، DMSO، بتائین، پلی اتیلن گلیکول یا آلبومین سرم گاوی به مخلوط واکنش شرایط تکثیر واکنش را می‌توانید به‌طور قابل توجهی بهبود دهید.
سخن آخر:
با دقت کردن به این نکات و در نظر گرفتن آن‌ها واکنش زنجیرهای پلیمراز به درستی انجام می‌پذیرد و بدون خطا یا آلودگی نتایج برای مرحله بعدی به کار گرفته می‌شود.
