10 اشتباه مهلک در روند تخلیص و استخراج RNA

استخراج RNA، خالص سازی RNA از نمونه­‌های بیولوژیکی است. RNA یک پلی نوکلئوتید تک رشته‌­ای ناپایدار می‌­باشد که بسیار مستعد تخریب است. کار با RNA (استخراج RNA) به دلیل ناپایداری شیمیایی RNA و به دلیل حضور همه جانبه آنزیم‌­های ریبونوکلئاز در سلول‌­ها و بافت‌ها سخت­‌تر است.

به دست آوردن RNA با کیفیت بالا اولین و اغلب حیاتی‌­ترین مرحله در انجام بسیاری از تکنیک‌­های مولکولی مانند RT-qPCR، تجزیه و تحلیل ترنسکریپتوم با استفاده از ngs ،digital PCR، آنالیز نورترن و و ساخت کتابخانه cDNA است.

روش‌های مختلفی در زیست‌شناسی مولکولی برای جداسازی RNA از نمونه‌ها استفاده می‌شود که رایج‌ترین آنها استخراج با استفاده از گوانیدین تیوسیانات-فنل-کلروفرم است. روش لیز و آزادسازی مبتنی بر ستون دارای ظرفیت توان عملیاتی بالایی است.

الکتروفورز تکنیکی است که از جریان الکتریکی برای جداسازی DNA، RNA یا پروتئین­‌ها بر اساس ویژگی‌­های فیزیکی مانند اندازه و بار استفاده می­‌کند. در این مقاله به 12 اشتباه حین انجام فرایند الکتروفورز اشاره کردیم که مطالعه آن می‌تواند از بروز این اشتباهات جلوگیری کند.

۱۲ اشتباه رایج در فرایند الکتروفورز

اشتباهات ممکن در روند استخراج RNA

در بخش ذیل به چند مورد از اشتباهات معمول که ممکن است در طی پروسه استخراج RNA رخ دهد؛ می­‌پردازیم:

• عدم انکوباسیون ستون پس از افزودن بافر آزادسازی:

در صورتی که پس از افزودن بافر آزادسازی به ماتریکس ستون، بلافاصله سانتریفیوژ صورت گیرد؛ این امر می­‌تواند منجر به آزادسازی ناقص RNA از ستون شود.

برای جلوگیری از این مشکل باید 5-10 دقیقه انکوباسیون در دمای اتاق پس از افزودن بافر آزادسازی صورت گیرد.

علاوه بر این پس از سانتریفیوژ می‌توان محلول آزادسازی حاوی RNA را مجدداً در قسمت مرکزی ماتریکس ستون افزود و پس از 1-2 دقیقه انکوباسیون دردمای اتاق سانترفیوژ انجام داد.

• عدم استفاده ازDNase:

یکی از مواردی که می‌تواند در فرایندهای پایین دستی نمونه RNA استخراج شده اختلال ایجاد کند؛ باقی ماندن DNA روی ستون است.

برای جلوگیری از این مشکل می‌توان قبل از افزودن بافر آزادسازی به ماتریکس ستون، تیمار ستون با DNase و یا افزودن DNase به لیز سلولی را انجام داد. این امر منجر به آزادسازی RNA بدون آلودگی DNA می‌شود.

• استفاده از مقدار زیاد از نمونه اولیه:

یکی از مواری که منجر به غلظت پایین RNA تخلیص شده و یا کیفیت پایین آن می‌شود؛ استفاده از مقدار زیاد نمونه می‌باشد.

جهت رفع این مشکل باید درحین فرایند استخراج مطابقت مقدار نمونه مورد استفاده و بافرهای هر مرحله را مدنظر قرار داد.

از طرفی هر ستون ظرفیت مشخصی برای بارگذاری دارد و استفاده از مقدار بیش از اندازه نمونه اولیه باعث اختلال در جذب و آزادسازی RNA موردنظر می‌شود. بنابراین باید مقدار نمونه اولیه طبق پروتوکل مورد استفاده قرار گیرد.

• عدم سانتریفیوژ ستون ‌پس از شستشوی نهایی:

یکی از مواردی که در فرایندهای پایین دستی RNA استخراج شده اختلال ایجاد می‌کند؛ انتقال نمک و یا  اتانول به RNA استخراج شده است.

برای جلوگیری از این مشکل پس از شستشوی نهایی با بافر شستشوی RNA، حتماً ستون تخلیص RNA را به صورت خالی به مدت 2 دقیقه با حداکثر دور سانتریفیوژ کنید. علاوه براین مرحله شستشوی اضافی را انجام دهید و یا مدت زمان سانتریفیوژ نهایی را بیشتر کنید.

کیت استخراج RNA ویروسی

• عدم استفاده از سانتریفیوژ یخچال دار:

ماهیت RNA به صورت ناپایدار است و در دمای بالای 4 درجه سانتی‌گراد به سرعت تخریب شده و کارایی آن کاهش می‌یابد.

بدین منظور تمامی مراحل سانترفیوژ در روند استخراج RNA باید توسط سانتریفیوژ یخچال دار انجام شود. به  این دلیل قبل از آغاز پروسه استخراج، سانتریفیوژ یخچال دار را روی 4 درجه تنظیم کنید؛ تا از حفظ دمای ‌پایین در تمامی مراحل اطمینان حاصل کنید.

• عدم استفاده از مواد مصرفی RNase free:

یکی دیگر از مواردی که ممکن است منجر به استخراج RNA تخریب شده و با خلوص و کیفیت پایین شود؛ عدم استفاده از مواد مصرفی RNase free در تمامی مراحل پروسه استخراج است.

از آنجا که RNA  ناپایدار است و نسبت به تخریب توسط RNase بسیار مستعد است؛ باید سطح میز کار برای پروسه استخراج کاملا تمیز و استریل بوده و همینطور تمامی نوک سمپلرها و میکروتیوب­‌ها از نوع free  RNase  استفاده شود. باید تمام ظروف شیشه‌­ای و پلاستیکی با عوامل غیرفعال کننده RNase  تیمار شوند.

ظروف شیشه‌­ای باید حداقل 4 ساعت در دمای +180 درجه سانتیگراد گرمادهی شوند. البته توجه داشته باشید که اتوکلاو به تنهایی برای حذف RNase ها کافی نیست.

ظروف پلاستیکی (2 ساعت، +37 درجه سانتیگراد) را در 0.1 مولار NaOH / 1میلی مولار (EDTA  یا اتانول مطلق با 1٪ SDS ) خیس کنید، با آب تصفیه شده DEPC یا DMPC (دی متیل پیروکربنات) شستشو داده و به مدت 15 دقیقه تا +100 درجه سانتیگراد در اتوکلاو گرم کنید.

• عدم استفاده از دستکش استریل:

عدم استفاده از دستکش و یا استفاده از دستکش آلوده می‌تواند منجر به اختلال در روند استخراج و آزادسازی RNA تخریب شده شود.

برای جلوگیری از این مشکل باید از عدم تماس دستکش با نوک سمپلرهای مورداستفاده، لبه داخلی میکروتیوب‌ها، نوک ستون‌ها اطمینان حاصل کنید.

‌پیشنهاد می‌گردد برای اطمینان از عدم انتقال الودگی از دستکش های پلاستیکی یکبار مصرف استفاده کرد، و در پایان هر مرحله دستکش را دور انداخته و با دستکش جدید مرحله بعدی را انجام دهید.

• عدم استفاده از DEPC واتر:

وجود نوکلئازهایی مانند DNase و RNase در آب می‌تواند نمونه­‌های مولکولی گران‌­بها را تخریب کند و حتی موجب بروز خطا در آزمایشات شود.

برای جلوگیری از از دست رفتن نمونه DNA و  RNA، ضروری است که از آب بسیار خالص و فاقد نوکلئاز استفاده شود. آب بدون نوکلئاز عاری از DNAse و RNAse است و برای غیرفعال کردن RNAse و DNAse با DEPC (دی اتیل پیروکربنات) تیمار می­‌شود و یا اتوکلاو می‌­شود.

• عدم استفاده از مهارکننده‌­های RNase:

مهارکننده‌های RNase می‌توانند برای محافظت از RNA در برابر تخریب در حین جداسازی و خالص‌سازی استفاده شوند.

این مهارکننده‌­ها به RNase ها متصل می­‌شوند و از تخریب مولکول‌­های آسیب پذیر RNA در حین دستکاری در آزمایشگاه جلوگیری می‌کنند.

• استفاده از نمونه های قدیمی!

نمونه‌­هایی که در شرایط نامناسب (و حتی در شرایط مناسب!) به مدت طولانی نگه داری می‌شوند؛ به‌­طورمعمول دچار تخریب بافتی شده و در نتیجه آنزیم‌­های RNase سلولی آزاد می­‌شوند.

در نتیجه کیفیت و کمیت RNA استخراج شده به شدت کاهش پیدا می­‌کند. توصیه می­‌شود نمونه­‌ها در اسرع وقت مورد استخراج RNA قرار گیرد.

در صورتی­که ناگزیر از نگه داری بافت هستید؛ نمونه را در نیتروژن مایع، یا دمای منفی 70 درجه پایدار و یا داخل محلول RNAlater نگه داری کنید.