10 نکته ضروری در استخراج ژل

در بیولوژی مولکولی، استخراج ژل یا جداسازی ژل تکنیکی است که برای جداسازی قطعه مورد نظر (DNA یا محصول حاصل از PCR) از ژل آگارز به دنبال الکتروفورز ژل آگارز استفاده می‌شود.

در اینجا 10 نکته وجود دارد که به شما کمک می‌کند بهترین نتایج ممکن را از فرایند استخراج از ژل بگیرید.

همچنین بخوانید: 12 اشتباه رایج در فرایند الکتروفورز

• از بافر تازه برای الکتروفورز ژل آگارز استفاده کنید.

بافر الکتروفورزی که چندین مرتبه مورد استفاده قرار گرفته است؛ کارایی بازیابی قطعه موردنظر را پس از برش و تخلیص از ژل کاهش می‌دهد. بدین منظور از بافر تازه برای الکتروفورز ژل دارای قطعه موردنظر استفاده کنید.

• ژل آگارز خود را کاملاً ذوب کنید.

یکی از مهم‌ترین نکانی که باید در هنگام استخراج از ژل در نظر داشته باشید تا بازدهی مناسبی ببینید؛ این است که پلاگ ژل حاوی قطعه موردنظر به‌خوبی ذوب شود.

در صورتی که ژل به خوبی ذوب نشده باشد، DNA در داخل آگاروز به دام می‌افتد و نمی‌توان آن را به درستی استخراج کرد.

همچنین بخوانید: 10 نکته مهم در فرایند PAGE

 

• قرار گرفتن در معرض نور UV را به حداقل برسانید.

برای برش باند موردنظر از روی ژل بهتر است از ترانسلومیناتور با لامپ LED استفاده کنید.

در صورتی‌که دسترسی به ترانسلومیناتور با لامپ LED ندارید؛ برش ژل را با سرعت عمل بالا زیر نور UV جدا کنید؛ زیرا قرار گرفتن در معرض نور UV به DNA آسیب می‌رساند. در صورتی‌که برش ژل به‌سرعت انجام شود، آسیب وارده به DNA ناچیز خواهد بود.

• از کوچکترین پلاگ آگارز ممکن استفاده کنید.

دلایل زیادی برای این یکی وجود دارد!

هرچه آگارز در محلول کمتر باشد، استخراج کارآمدتر خواهد بود. هرچه پلاگ آگارز شما بزرگتر باشد، مدت بیشتری طول می‌کشد تا ذوب شود.

همچنین، اگر پلاگ بیشتر از 160 میلی گرم باشد، حجم بافر آگارز از حجم مخزن ستون (800 میکرولیتر) بیشتر می‌شود و نیاز است که نمونه شما در دو مرحله روی ستون بارگذاری شود.

همچنین بخوانید: 10 نکته ضروری در واکنش PCR

• اطمینان حاصل کنید که اتانول در محلول شما وجود ندارد.

آلودگی اتانول می‌تواند با کاربردهای پایین دستی تداخل داشته باشد. فریت‌ها که در ستون‌های بسیاری از سازندگان رایج است، اغلب قطرات کوچکی از بافر را در خود نگه می‌دارند که به‌عنوان حفظ بافر نیز شناخته می‌شود.

این می‌تواند مایع شستشوی شما را آلوده کند. بدین منظور بعد از شستشوی ستون یک سانتریفیوژ 2-3 دقیقه با حداکثر دور انجام بدهید تا مطمئن شوید که ستون شما فاقد اتانول است.

• بافر Elution خود را برای قطعات بزرگ تا 50 درجه سانتیگراد گرم کنید.

گرم کردن بافر Elution قبل از افزودن بر روی ستون می‌تواند کارایی را به‌خصوص برای قطعات بزرگ (> 10 کیلوبایت) افزایش دهد.

همچنین بخوانید: 10  اشتباه مهلک در روند تخلیص و استخراج RNA

• از مقدار توصیه شده از محلول بافر لیز کننده استفاده کنید.

پروتکل‌های مختلف افزودن سه یا چهار حجم بافر محلول لیز کننده به وزن قطعه برش یافته را توصیه می‌کنند. بنابراین هنگام استفاده از کیت‌های برندهای متفاوت، حتماً از حجم توصیه شده استفاده کنید.

• برای تخلیص قطعات کوچک ( <200 جفت باز) از ایزوپروپانول استفاده کنید.

در صورتی‌که اندازه قطعه موردنظر شما کمتر از 200 جفت باز است؛ برای دستیابی به بازدهی بالاتر می‌توانید بعد از لیز کامل و قبل از انتقال محلول به ستون، به ازای هر 100 میلی گرم ژل حدود 100 میکرولیتر ایزوپروپانول به محلول اضافه کرده و به‌طور کامل با پیپتاژ محلول را همگن کنید.

• حجم مناسبی از بافر Elution را به ممبران ستون اضافه کنید.

برای دستیابی به غلظت بالاتری از DNA تخلیص شده، می‌توان حجم بافر Elution افزوده شده به ستون را به 30 میکرولیتر کاهش داد. در نظر داشته باشید که مقادیر کمتر از 30 میکرولیتر منجر به کاهش بازیابی قطعه موردنظر می‌شود.

پیشنهاد می‌کنیم: 10 نکته کلیدی در طراحی پرایمر

• بعد از افزودن بافر Elution ستون را چند دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید.

حداکثر بازیابی DNA از ستون به pH، قدرت یونی، حجم بافر Elution اضافه شده به ممبران ستون و زمان انکوباسیون بستگی دارد.

برای جذب بهتر بافر Elution افزوده شده به ممبران ستون و دستیابی به حداکثر بازیابی، ستون را به مدت 2-5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید و سپس سانتریفیوژ را انجام دهید.

سخن آخر در رابطه با استخراج ژل:

کیت استخراج DNA از ژل SIMBIOLAB

با توجه به نکات ذکر شده در سطور بالا، فرایند استخراج ژل فرایندی حساس است که جزئیات زیاد و بسیار ریزی دارد. با در نظر گرفتن این 10 نکته ضروری در استخراج ژل می‌توان استخراج را با کیفیت بالایی انجام داد.

کیت‌های استخراج DNA سیم بایولب، با کیفیت بسیار بالایی در بازار عرضه می‌شوند. برای سفارش این کیت‌ها، به‌خصوص کیت استخراج DNA از ژل با تخفیف می‌توانید خرید کنید.